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12 月：國內首款國產 PD-1 單克隆抗體藥物獲批，開啟腫瘤免疫治療“親民”時代

腫瘤免疫治療的火爆讓單克隆抗體藥物（下文簡稱單抗）的研究越來越受到關注，今天我們就來聊聊單抗的一大特性——電荷異質性。

抗體是指能與相應抗原特異結合的具有免疫活性的球蛋白，而單抗是由單一 B 細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。同其它蛋白一樣，單抗常常存在廣泛的翻譯后修飾和降解，如糖基化、碳端賴氨酸丟失、脫酰胺化、二硫鍵錯配、糖化和氧化等。幾乎這些所有的翻譯后修飾都會直接或間接的引起單抗表面電荷的變化，這就是單抗的電荷異質性。電荷異質性影響單抗的體外及體內的活性、安全性、可行性和質量，在新藥研發和生物類似藥的開發中都非常重要。

電荷異質性的檢測通常采用基于電荷分離的技術手段，如離子交換色譜、毛細管等電聚焦（CIEF），以及成像毛細管等電聚焦（iCIEF）等。與主峰  (Main peak)  相比，這些變異體峰通常被稱為酸性峰  (Acidic variants)  和堿性峰  (Basic variants) 。大部分的人源 IgGs 具有堿性的等電點，因此，陽離子交換色譜通常被用于分離。在主峰前面的峰通常稱為酸性峰，因為其帶有的正電荷較少，洗脫較快；在主峰后面的峰稱為堿性峰。酸堿峰的鑒定采用離線收集鑒定或多維液相-質譜聯機在線鑒定。

圖 1. 陽離子交換色譜分離酸堿峰示例圖

毛細管等電聚焦（CIEF）是電荷異質性表征的主要手段，但采用 CIEF 分離時收集餾分用于鑒定非常困難，所以 CIEF 通常用于監控電荷異質性而不能用于表征。質譜檢測雖然廣泛應用于單抗的表征，但是將 CIEF 和 MS 聯機一直是非常大的挑戰。質譜在線檢測的缺失也限制了 CIEF 在蛋白電荷異質性的表征上的應用。將 CIEF 分離的高分辨特性和質譜的表征能力結合起來是電荷異質性表征迫切需要的技術。

Agilent 7100 CE-QTOF 聯機的特點

無與倫比的毛細管分離的分辨率：甘油改性劑降低非 CIEF 電泳遷移和區帶展寬

兩性電解質：兼顧電泳分辨率和質譜靈敏度

質譜友好的陽極液和陰極液

優化的鞘流液組成：有效的聚焦、遷移和電噴霧離子化

納流級別的鞘流液流速：基于電滲流技術的納流鞘流液最大限度提高檢測靈敏度

優化的 CIEF 運行參數：進樣量、電場強度、壓力

靈敏度高、抗污染的質譜：Agilent 6200 系列 TOF，6500 系列 Q-TOF

采用等電點標記物（pI markers）進行驗證，等電點和遷移時間之間具有良好的線性相關性 (R^2=0.99)。此外，CIEF-MS 方法采集的四種單抗的電荷變異體分離的輪廓圖也通過成像毛細管等電聚焦紫外方法比對驗證一致。pI markers 的絕對遷移時間的相對標準偏差小于 5%（n=4）。貝伐單抗三次進樣的相對遷移時間 RSD 小于 1%，絕對遷移時間小于 2.3%，峰面積的 RSD 小于 7%。并且，單抗的電荷變異體可通過質譜直接測得其分子量。

CIEF-MS 采集的電荷變異體輪廓分布和 iCIEF-UV 檢測具有高度的一致性。iCIEF-UV 通過全柱成像檢測去除了等電聚焦后分析物遷移到檢測器端的步驟，CIEF-MS 和 iCIEF-UV 檢測結果的高度一致性證明了在線 CIEF-MS 分析單抗電荷變異體史無前例的高分辨率。除了高分辨率之外，該方法具有非常好的重現性。

CIEF-MS 電荷異質性分析的應用實例大集結

貝伐珠單抗的分析

CIEF-MS 和 iCIEF-UV 分析得到的酸堿峰比例接近，分別為酸性峰: 主峰: 堿性峰= 23% : 72% : 5% 和 27% : 68% : 5%。除了 CE 的高分離度之外，質譜數據優異的原始譜圖是實驗分析制勝的關鍵，尤其是在鑒定跟主峰質量差別很小的變異體時，如在分析一個脫酰胺  (+1Da)  質量差時，一款性能優異的質譜是 CIEF-MS 分析的必備之選。

貝伐珠單抗的主峰分子量為 149 202 Da，堿性峰 B1 和主峰之間的質量差為 +128 Da，和碳端賴氨酸 (+128 Da, +1K)  異質性匹配；堿性峰 B2 (?=-17Da)  和氮端焦谷氨酸環化修飾 (-17Da)  匹配；酸性峰 A1 (?= 1Da)  和脫酰胺修飾匹配。酸性峰 A1 和主峰只有 1 Da 的質量差別，雖然我們會擔心質譜準確度因素帶來的不確定性，但酸性峰的位置和正好 1 Da 的質量差讓我們有理由相信酸性峰 A1 是脫酰胺的修飾峰。A2 峰的信號非常弱，可能是高糖基化修飾的峰。

曲妥珠單抗的分析

曲妥珠單抗和貝伐珠單抗的電荷異質性分布的差異較大。iCIEF-UV 測得的低含量堿峰在CIEF-MS上未檢出，同時其對酸峰的分離效果也優于 CIEF-MS 分離。質譜檢測結果清晰的展示了酸性峰中四種主要的糖型變異體。曲妥珠單抗的主峰分子量為148 224 Da，酸性峰 A1 (?m = +1Da) 和酸性峰 A2 (?m = +2Da) 和脫酰胺修飾匹配，并且和 2D CZE-MS 的結果一致。

英夫利昔單抗的分析

英夫利昔單抗的三個電荷變異體峰在 CIEF-MS 上有良好的分離。解卷積結果顯示兩個堿峰為碳端賴氨酸變異體，堿性峰 B1 (?m = +258 Da) 和兩個賴氨酸匹配；堿性峰 B2 (?m = +129 Da) 和一個賴氨酸匹配；酸性峰 A (?m = +5 Da) 小的質量偏差顯示其可能為脫酰胺的修飾。

西妥昔單抗的分析

西妥昔單抗是人鼠嵌合的 IgG-1 單抗，具有高度的微觀不均一性，該特性主要源于高度復雜的糖基化修飾。西妥昔單抗重鏈的 Fab 和 Fc 上各有一個糖基化位點，同時有碳端賴氨酸的不完全剪切，這些高度的異質性會造成分離上的困難。采用 CIEF-MS 實現了八個電荷變異體的良好分離，不僅和 iCIEF-UV 的結果一致，同時也和文獻報道一致。但是由于西妥昔單抗復雜的糖基化修飾，通過質譜獲得的分子量信息不足以反應修飾的情況。

西妥昔單抗亞基水平的分析

針對西妥昔單抗這類具有復雜異質性的抗體，通過 IdeS 酶切和 DTT 還原降低其復雜程度，更利于質譜檢測。通過高分辨質譜檢測，IdeS 酶切后的八個變異體峰及 IdeS 酶切同時 DTT 還原后得到的 11 個變異體都得以檢測。研究發現，西妥昔單抗的電荷異質性主要源于 Fc 區末端賴氨酸的異質性、Fd’ 區 N-羥乙酰神經氨酸和可能存在的脫酰胺修飾。輕鏈上未發現有電荷異質性。

安捷倫 CE-QTOF 解決方案不僅兼顧了毛細管電泳的高效分離，離子源接口的高靈敏度和高分離度，也實現了質譜的高靈敏高分辨檢測。在完整蛋白分析的層次上增加亞基水平的解決方案，即使是具有高度復雜異質性的抗體分析也能輕松應對。

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參考文獻：

1. 安捷倫應用文獻 5994-0672EN

2. Jun Dai,*,? Jared Lamp,? QiangweiXia,? and Yingru Zhang?, Capillary Isoelectric Focusing-Mass SpectrometryMethod for the Separation and Online characterization of Intact Monoclonal AntibodyCharge Variants. Anal Chem. 2018 Feb 6;90(3):2246-2254

3. Jun Dai, and Yingru Zhang, AMiddle-Up Approach with Online Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometryfor In-depth Characterization of Cetuximab Charge Heterogeneity. Anal. Chem.,2018, 90 (24), pp 14527–14534