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液質聯用法在皂苷體內代謝產物分析中的研究

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  皂苷是許多中草藥如人參、遠志、桔梗、甘草、知母和柴胡等的主要有效成分之一,藥理研究表明皂苷類成分具有抗菌、抗腫瘤、調節機體代謝及免疫、治療心血管疾病和糖尿病等的生物活性。采用現代化學,藥理學,生物學,醫學,生物信息學等多學科研究方法,對常用中藥及復方進行系統的化學成分,體內過程,配伍規律,作用機制等研究,闡明藥效物質和作用機理;將中藥有效物質及其配伍研制成為療效確切,安全性高,有效成分清楚,作用機理明確,質量可控,劑型先進,服用方便的現代中藥;同時探討有效成分的生源途徑和生物合成。詮釋中醫藥理論,創制現代中藥,促進中藥現代化和國際化。

  采用色譜-質譜連用法進行皂苷體內代謝產物分析,為闡明中藥的治病機制提供有利的證據。液相色譜-質譜聯用(LC/MS)技術是一項集高效液相色譜HPLC的高分離性能與串聯質譜的高靈敏度、高專屬性優點于一身的生物分析技術,它不需要分析物之間實現完全的色譜分離,其多窗口檢測功能允許同時對多個成分進行定量分析。

  中草藥及其方劑成分復雜,HPLC與UV或DAD檢測器相聯接,對于單個色譜峰僅能提供保留時間及紫外吸收等信號,而對未知成分所能提供的結構信息相當有限。色譜峰的指認必須有對照品,而大多數中藥化學成分的對照品很難獲得,而對于體內中藥藥物分析,一般的檢測技術也難以滿足給藥后血藥濃度的測定要求。

  HPLC/MS的應用可以集HPLC的高分離效能與串聯質譜的高靈敏度、高專屬性的優點于一體,,并能夠給出被測組分的分子量信息,通過多級串聯質譜分析,還可以得出被測物質的結構信息。

  1、液相色譜串聯質譜法進行人血液中偽人參皂苷代謝產物分析

  建立液相色譜串聯質譜法測定人血漿中偽人參皂苷GQ濃度。在血漿樣品中加入適量內標,以乙酸乙酯萃取后采用Waters Xevo TQSLC-MS/MS進行分析。采用Poroshell 120 EC C8色譜柱(2.1 mm×50 mm,2.7μm),柱溫40℃,以甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨水溶液(80∶20)為流動相,流速0.3 mL·min-1;采用多反應離子監測(MRM)的掃描模式,以電噴霧離子源(ESI)在負離子電離模式下進行測定。

  該方法的線性范圍為2.500~5000 ng·m L-1,最低定量限為2.500 ng·m L-1,日內、日間精密度均小于15%,準確度在85%~115%之間,萃取回收率約9%~11%,基質效應約66%~73%,穩定性考察結果良好。藥動學試驗結果表明,靜注偽人參皂苷GQ 120 mg·次-1,每日1次,連續用藥5 d后,達峰時間為2 h,半衰期約10 h。試驗第1 d和第5 d主要藥代動力學參數基本一致,計算蓄積系數分別是RC max=0.964±0.099,和RAUC=0.965±0.181,兩者均接近1。

  該方法適用于偽人參皂苷GQ的人體藥代動力學研究。在此給藥方案下,偽人參皂苷GQ在人體內沒有明顯蓄積現象,連續給藥不影響偽人參皂苷GQ的人體藥代動力學過程。

  2、LC-MS/MS進行大鼠血液中丫蕊花皂苷代謝產物分析

  采用高效液相-串聯質譜(LC-MS/MS)法測定大鼠血漿中丫蕊花皂苷G的含量,并研究其在大鼠體內的藥動學特征。方法采用Phenomenex Luna C18色譜柱(150 mm×2 mm,3μm),流動相為乙腈-水(含0.1%甲酸),流速0.2 mL·min~(-1),以人參皂苷Rg3為內標;分別于大鼠尾靜脈注射丫蕊花皂苷G 0.25、0.5、1 mg·kg-1,給藥后于不同時間點采血,經固相萃取法處理后,采用上述LC-MS/MS法測定血藥濃度;采用DAS 3.0軟件、非房室模型擬合藥代參數。結果 0.01~1.0μg·m L-1丫蕊花皂苷G與峰面積的線性關系良好,方法學考察均符合要求;大鼠靜脈給藥后的血漿藥動學參數為:t1/2=3.447±0.898 h、MRT0-∞=4.568±1.075 h、CL=0.858±0.171L·h-1·kg,AUC、Cmax隨給藥劑量的增加而等比增大,符合線性藥動學特征。此方法簡便、靈敏,結果準確,適用于大鼠血漿中丫蕊花皂苷G的含量測定及其藥動學研究。

  也有研究者采用HPLC-ESI-MS/MS方法對血塞通注射液中皂苷進行定性定量分析。還有研究者采用加壓溶液萃取法(PLE)與HPLC-DAD-MS技術測定人參葉和人參中9種皂苷及2種聚乙炔醇類化合物(人參環氧炔醇,人參醇),這是一種快速檢測中藥的方法,對于控制人參的質量很有幫助。

  建立可靠的分析方法是進行藥物體內代謝產物分析的前體,隨著現代色譜聯用技術的發展,體內多微量代謝產物的分離、鑒定已經成為了一個連續過程。尤其是LC-MS樣品前處理簡單,一般不要求水解或衍生化處理,運用LC-MS技術不僅可以避免復雜繁瑣的分離、純化代謝產物的工作,而且可以分離鑒定難以辨識的體內痕量代謝產物。


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